简答题

概述核酸序列测定的方法和应用领域。

正确答案

D.NA的序列测定目前多采用Sanger提出的链终止法,和Gilbert提出的化学法。其中链终止法经不断改进,使用日益广泛。链终止法测序的技术基础主要有:
①用凝胶电泳分离DNA单链片段时,小片段移动,大片段移动慢,用适当的方法可分离分子大小仅差一个核苷酸的DNA片段。
②用合适的聚合酶可以在试管内合成单链DNA模板的互补链。反应体系中除单链模板外,还应包括合适的引物,4种脱氧核苷三磷酸和若干种适量的无机离子。如果在4个试管中分别进行合成反应,每个试管的反应体系能在一种核苷酸处随机中断链的合成,就可以得到4套分子大小不等的片段,如新合成的片段序列为-CCATCGTTGA-,在A处随机中断链的合成,可得到-CCA和-CCATCGTA两种片段,在G处中断合成可得到-CCATCG和-CCATCGTTG两种片段。在C和T处中断又可以得到相应的2套片段。用同位素或荧光物质标记这4套新合成的链,在凝胶中置于4个泳道中电泳,检测这4套片段的位置,即可直接读出核苷酸的序列。在特定碱基处中断新链合成最有效的办法,是在上述4个试管中按一定比例分别加入一种相应的2,3-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),由于ddNTP的3位无-OH,不可能形成磷酸二酯键,故合成自然中断。如上述在A处中断的试管内,既有dATP,又有少量的ddATP,新合成的-CCA链中的A如果是ddAMP,则链的合成中断,如果是dAMP,则链仍可延伸。因此,链中有几个A,就能得到几种大小不等的以A为末端的片段。如果用放射性同位素标记新合成的链,则4个试管中新合成的链在凝胶的4个泳道电泳后,经放射自显影可检测带子的位置,由带子的位置可以直接读出核苷酸的序列。采用T7测序酶时,一次可读出400多个核苷酸的序列。近年采用4种射波长不同的荧光物质分别标记4种不同的双脱氧核苷酸,终止反应后4管反应物可在同一泳道电泳,用激光扫描收集电泳信号,经计算机处理可将序列直接打印出来。采用毛细管电泳法测序时,这种技术一次可测定700个左右核苷酸的序列,一台仪器可以有几十根毛细管同时进行测序,且电泳时间大大缩短,自动测序技术的进步加快了核酸测序的步伐,现已完成了包括人类在内的几十个物种的基因组测序。
R.NA序列测定最早采用的是类似蛋白质序列测定的片段重叠法,Holley用此法测定酵母丙氨酸tRNA序列耗时达数年之久。随后发展了与DNA测序类似的直读法,但仍不如DNA测序容易,因此,常将RNA反转录成互补DNA(cDNA),测定cDNA序列后推断RNA的序列,目前16SrRNA1542b的全序列测定,23SrRNA2904b的全序列测定,噬菌体MS2RNA3569b的全序列测定均已完成。

答案解析

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