质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？

目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶（如EcoRI）消化酶切后，两者的两端均具有相同的粘性末端，称为单酶切点的粘性末端，又称全同源性粘性末端。
高背景：载体经单一限制性核酸内切酶切割后，载体分子易于自我环化，既不利于目的基因的重组连接，大大降低阳性克隆效率，又可使非重组性载体造成高背景。为了防止载体的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的5P以抑制DNA的自我环化。在连接反应中，具有5’-P，的目的基因DNA片断可有效地与去磷酸化质粒DNA载体通过粘性末端发生互补连接，尽管产生的重组DNA分子于连接点含有两个缺口的开环分子，尽管在转化时其转化效率高于线性低于闭和环，但转化大肠杆菌后，在菌体内其缺口可获得修复。
双向插入：经单一限制核酸内切酶（如EcoRI）切割的目的基因和载体，因二者的性末端是相同的，因此在连接反应中，目的基因可发生双向插入，载体对目的基因表达是有方向的，而目的基因可双向与之相连，这种连接若以克隆目的基因片段为目的没有影响，若以表达为目的，我们就要对插入的片段进行方向鉴定，因目的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转录的，一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就不能正确转录目的基因的mRNA。若构建表达DNA重组体选用双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组，以便定向克隆。

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