简答题

试述外源基因表达产物的检测方法。

正确答案

(一)特异性mRNA的检测
Northern杂交,即RNA-DNA杂交分析,是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。与Southern杂交类似,检测目的RNA的存在与否及含量。
(二)报告基因的酶法检测
(1)报告基因:其表达产物及其功能在未转化的植物细胞中并不存在;其表达产物便于检测。
(2)目前动物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因,主要有:β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)、氯霉素乙酰转移酶基因(CAT基因)、胸苷激酶基因(cA)、二氢叶酸还原酶基因(DHFR)等。
(三)免疫学检测
(1)免疫沉淀法
(2)酶联免疫吸附法(ELISA)
ELISA是一种利用免疫学原理检测抗原、抗体的技术。它与经典的以同位素标记为基础的液-液抗原-抗体反应体系不同之处是建立了固-液抗原-抗体反应体系,并采用酶标记。抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍保持其活性;抗原或抗体与酶交联成酶标抗原或抗体后,仍分别保持其免疫活性和酶活性。酶标抗原或抗体与相应抗体或抗原反应后,结合在免疫复合物上的酶遇到相应的底物时,可以催化底物的水解、氧化或还原,从而产生有色物质。颜色反应的深浅与相应抗体或抗原量相关。
(3)Western印迹法
(4)固相放射免疫(RIA)法
RIA法是一种定量测定外源表达蛋白的方法。该法具有很高的灵敏度,可检测出1pg的靶蛋白。
(四)表达产物的生物学活性检测
当外源基因的表达产物是一种酶蛋白时,可根据酶的催化反应来确定外源基因的表达与否和表达的程度。常见的有:淀粉酶、碱性磷酸酶、脂肪酶等。

答案解析

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