简答题

简述原位杂交的步骤。

正确答案

原位杂交是应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交体,然后应用组织化学或免疫化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术。操作步骤如下:
(1)载片的清洁与处理载片的清洁很重要,特别不能有核酸酶的污染。为了在后续的杂交和冲洗等步骤中防止组织或细胞从载片上脱落,可以用多聚赖氨酸涂抹载片。
(2)组织与细胞的固定进行原位杂交的细胞或组织必须经过固定处理,常使用4%的多聚甲醛
(3)探针对探针的设计与方法根据被测定的核苷酸序列来决定。同时为了探针的渗入,用于细胞与组织原位杂交的探针均比较短,而用于细胞染色体原位杂交,常使用较长的探针以增强杂交的信号。
(4)湿盒原位杂交中每张标本所用的杂交液比较少,为防止杂交体系中的液体蒸发造成杂交液浓缩,甚至干燥,故应该使用湿盒。
(5)细胞组织杂交前处理原位杂交遵循核酸杂交的一般原则,但不同的是由于组织和细胞中的核酸都与细胞内的蛋白质结合,以核酸蛋白复合体的形式存在,固定过程中固定液的交联作用使生物分子形成网格,影响探针的穿透力,阻碍杂交体的形成,因此必须使用去污剂和/或蛋白酶对组织和细胞进行部分消化以除去核酸表面的蛋白质,使探针获得最大的穿透力。

答案解析

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