简答题

可采用哪些方法进行目的片段与载体的连接?

正确答案

(1)目的片段与载体经相同的限制性内切酶或同尾酶切割,产生匹配的粘性末端,可直接进行连接。
(2)目的片段与载体经限制性内切酶切割后,产生平末端,也可直接进行连接。但是由于平末端连接效率较低,可采用下面的方法进行连接。
(3)同聚物加尾法:利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸,制成人工黏性末端,外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC.,然后在DNA连接酶的作用下涟接成为重组的DNA。这种方法的核心是利用末端转移酶的功能,将核苷酸转移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3’-OH上。以Mg2+作为辅助因子,该酶可以在突出的3’-OH端逐个添加单核苷酸,如果用Co2+作辅助因子则可在隐蔽的或平末端的3’-OH端逐个添加单个核苷酸。
(4)接头连接法:将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子加到载体或外源DNA的分子上,在这一小段DNA分子上有某种限制性内切核酸酶的识别序列,这样便在载体DNA和外源DNA上制造出新的酶切点,产生匹配的黏末端以便于连接。这一小段含有酶切点的DNA分子称为连接器分子。
(5)PCR接头法:设计含有限制酶切位点的引物,在PCR过程中在目的片段直接加上接头

答案解析

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