简答题

何谓反义技术?试述其主要分类及其原理。

正确答案

反义技术(antisense technique)是根据碱基互补原理,用人工或生物合成特异性互补DNA或RNA片段(即反义核酸),使之能特异地与目的核酸片段互补结合,从而抑制甚至阻断目的基因表达的一种技术。根据所用反义核酸的不同,反义技术可分为反义寡核苷酸技术、反义RNA技术和核酶技术等。
反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASON)技术根据碱基互补结合原理,人工或生物合成与目的DNA或RNA互补的寡核苷酸,将其导入细胞,通过其与胞内目的DAN或RNA特异结合,抑制甚至阻断目的基因转录和/或翻译,达到人工调控基因表达的目的。
ASON主要通过一下几种机理调节基因表达:
(1)形成三螺旋DNA(triplex DNA)或D环(D-loop)结构;
(2)与细胞内目的mRNA互补结合,形成DNA-RNA异源杂交体,激活核糖核酸酶H(RNase H)特异性降解mRNA;
(3)与核内不均一RNA(hnRNA)互补结合,破坏正常剪接形成mRNA的过程;
(4)与核糖体rRNA的mRNA结合位点互补结合,阻止mRNA的结合和翻译启动;
(5)ASON与mRNA互补结合,破坏其进入正确翻译部位的途径。
反义RNA(antisense RNA)是一类自身没有编码功能,但能通过配对碱基间氢键与目的RNA特别是mRNA的特定区域补结合,从而抑制基因表达的小分子RNA。在实际操作中,可采用自然存在或人工合成的反义RNA,通过基因重组将其反向插入到表达载体,然后以此重组表达载体转染细胞,在细胞内产生大量翻译RNA。
其作用机理包括:
(1)与引物RNA结合或作用于引物前体,阻止引物与DNA结合,抑制DNA复制;
(2)在转录水平或转录后加工过程中,阻止特定基因转录,或与mRNA5’端结合,阻止加帽过程;或与剪接位点结合,阻止mRNA的剪接形成等;
(3)与SD序列或编码区关键点如AUG结合,阻止mRNA与核糖体结合,阻断翻译等。
核酶是具有生物催化活性的RNA,能按碱基互补原理识别特定核苷酸序列并特异地剪切底物RNA分子。根据其分子大小可分为大分子核酶和小分子核酶两种,前者包括I型内含子(group I intron)、II型内含子(group II intron)和核糖核酸酶P的RNA亚基,均由数百到数千核苷酸组成;小分子核酶按结构分为锤头(hammerhead)型、发夹(hairpin)型等,大小多在35-155个核苷酸之间,应用广泛。根据核酶的结构特点和目的RNA的特异性序列特征,设计并合成针对目的RNA的核酶基因,构建表达载体,导入细胞内,核酶基因表达后通过特异序列识别并降解目的RNA。

答案解析

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